La grande pala del "Cristo in gloria", commissionata al Ghirlandaio da Lorenzo de' Medici per la Badia di San Giusto è un esempio eloquente della capacità del pittore fiorentino di affidarsi al proprio fecondo estro narrativo e di tradurre con fedeltà documentaria gli aspetti della vita e della società del suo tempo. Le stanno vicine una pala attribuita al Maestro di S. Spirito e una tavola di Leonardo da Pistoia, imitante la Madonna "del baldacchino" di Raffaello.
Nella sala seguente sono raccolte due opere di Luca Signorelli: una Madonna col Bambino e Santi dove appare lo schema a piramidi rovesciate nella disposizione delle figure e la tavola dell'Annunciazione dove la figura dell'angelo dalle vesti svolazzanti e la Madonna in piedi, in atto di ritirarsi, si compongono con l'architettura del portico in prospettiva.
Nella parete accanto è collocata l'opera che a buon diritto è considerata la perla della Pinacoteca: la pala raffigurante la Deposizione dalla croce del Rosso Fiorentino, firmata e datata 1521: dallo "sconficcamento" del corpo del Cristo dalla croce, in alto, si scende alla visione dei dolenti che piangono la morte del Salvatore, mentre la Maddalena con ardita invenzione iconografica anziché abbracciare la croce, si getta ai piedi della Madonna e il S. Giovanni si allontana dal gruppo, nascondendosi il volto fra le mani.
Usciti dalla sala detta "del Rosso Fiorentino", saliamo ancora una rampa di scale e ci portiamo nella sala detta "dei Manieristi" dove spiccano, fra le altre, le due tavole di Pieter De Witte rappresentanti il Presepe e il Compianto, opera quest'ultima di splendida qualità sia per l'impianto scenico e paesaggistico, sia per alcuni motivi iconografici come quello della Maddalena che riecheggia la Pietà di Fra Bartolomeo di Pitti e come il braccio sinistro del Cristo mollemente abbandonato dove appare un ricordo della michelangiolesca Pietà di S. Spirito. Memore della lezione di Jacopo Ligozzi è la suggestiva Natività della Vergine di Donato Mascagni per la rappresentazione dell'ambiente, la cui densa penombra è rotta dagli alti finestroni.
Segue la sala detta "della Quadreria" dove sono raccolte opere di particolare interesse storico e documentario, quali i frammenti di G. Bugiardini, i medaglioni dell'ambiente Tosini-Brina e alcune opere di scuola tedesca e fiamminga.
In ultimo ci viene incontro il capolavoro del volterrano Baldassare Franceschini, raffigurante la Madonna col Bambino e Santi, dove l'intonazione cromatica è tutta soffusa di grigi argentei e dove appare evidente la grande cultura del volterrano che spazia dal Correggio ai Caracci, da Pietro da Cortona al Cigoli, specie nella ricca dalmatica del S. Stefano.
Prima di lasciare il Palazzo si consiglia una sosta nello splendido ballatoio da dove si può ammirare uno sconfinato paesaggio e gli scavi archeologici del Teatro Romano di Vallebona.