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E’ a carattere conservativo e antiquario ed è una delle più importanti biblioteche storiche della Toscana. istituita nel 1786 con un lascito testamentario di circa 7.000 volumi da pate dell’abate ed erudito volterrano Mons.Mario Guarnacci, questa biblioteca è andata costantemente accrescendosi nel corso del tempo con acquisti, depositi e donazioni fino a raggiungere la ragguardevole dimensione attuale di circa 50.000 volumi. Tra questi spiccano un ingente patrimonio di 514 manoscritti (tra cui pregevolissimi codici miniati come l’Epitalamio composto da G.F.Marliano per le nozze di Bianca Maria Sforza con Giovanni di Mattia Corvino, con una celebre miniatura che riproduce l’effigie del grande re d’Ungheria), 273 incunaboli (di particolare interesse l’unico esemplare del Doctrinale di Alessandro de Villa Dei, stampato a Bologna presso Bazalerius de Bazaleriis nel 1489 o uno stupendo Breviarium Romanum su pergamena impresso a Venezia da Jenson nel 1478 e adorno di magnifiche miniature) e oltre 1.000 cinquecentine.
Moltissime sono le opere dei secoli XVII e XVIII, per lo più di argomento teologico-religioso, letterario e storico, oltre a trattati di botanica, medicina, geografia e varie discipline umanistiche. Da segnalare in particolare la ricchissima sezione locale, autentica e fondamentale memoria storica per la città di Volterra e i suo territorio. Alla stessa Biblioteca appartengono inoltre alcuni importanti fondi librari che mantengono tuttora intatta la loro fisionomia originaria come il Fondo Funaioli (circa 2.500 volumi, sec.XIX-XX) e il Fondo Pacciani (1450 volumi, sec.XIX) e notevoli depositi archivistici quali il Fondo Diplomatico (circa 3.000 pergamene di età compresa tra il 907 e il 1756), l’Archivio Maffei (258 filze, sec.XIV-XIX), le Carte Ricciarelli (sec.XVI-XIX), l’Archivio della Guardia Nazionale (1860-1870), l’Archivio dell’Accademia dei Riuniti (sec.XIX). Presso la Guarnacciana sono infine conservati in deposito l’Archivio e la Biblioteca dell’Accademia dei Sepolti con la pregevole Collezione Aulo Persio Flacco e l’interessantissimo Erbario Amidei.